我們的piggyBac shRNA干擾載體系統(tǒng)是一種可穩(wěn)定干擾多種細胞類型靶基因表達的簡單而有效的方法。這種基于轉座子的系統(tǒng)利用質粒轉染（非病毒轉導）將shRNA表達盒永久地整合到宿主細胞基因組中，由人類U6啟動子驅動表達的shRNA將會導致靶基因mRNA的降解。與合成siRNA相比，piggyBac shRNA干擾具有明顯的優(yōu)勢（見下文載體優(yōu)勢）。

PiggyBac shRNA干擾載體系統(tǒng)包含兩個載體，一個載體被稱為輔助質粒，負責編碼轉座酶；另一個載體被稱為轉座子質粒，包含兩個末端重復序列（TRs）以及兩者之間的被轉座區(qū)域，shRNA表達盒就克隆在這個區(qū)域。

當輔助質粒和轉座子質粒共轉染靶細胞時，輔助質粒產(chǎn)生的轉座酶將會識別轉座子的兩個TR元件，然后將被轉座區(qū)和兩個TR元件插入到宿主基因組中。轉座插入通常發(fā)生在包含TTAA序列的宿主染色體位點，并在轉座子兩側出現(xiàn)TTAA重復序列。PiggyBac屬于II類轉座子，通過“剪切—粘貼”的機制移動，從一個地方轉座到另一個地方，而不留下序列本身（恰好相反，I類轉座子是通過“復制—粘貼”的方式移動）。由于輔助質粒是通過瞬時轉染進入宿主細胞的，故會逐漸丟失。隨著輔助質粒的丟失，表達shRNA的轉座子在宿主基因組中變成了永久整合。當這些宿主細胞再次被輔助質粒轉染，整合的轉座子會再次通過“剪切—粘貼”的機制移動。

關于該載體系統(tǒng)的更多資料，請參考以下文獻。

我們的PiggyBac轉座子載體與輔助質粒是經(jīng)過優(yōu)化的，可在大腸桿菌中高拷貝復制，該載體系統(tǒng)對多種類型的靶細胞均具有高效的轉導效率。人類U6啟動子能夠驅動shRNA的高水平轉錄，同時，我們經(jīng)過優(yōu)化的shRNA莖-環(huán)序列可高效形成有效的干擾RNA。

永久性整合和干擾：常規(guī)質粒轉染只能實現(xiàn)外源基因的瞬時表達，這種外源基因會隨著宿主細胞的分裂而不斷丟失，在快速分裂的細胞中顯得尤為顯著。相反，將PiggyBac轉座子載體和輔助質粒一起轉染到哺乳動物細胞中，由于轉座子在轉座酶的作用下，轉座子上的DNA序列能穩(wěn)定地整合到宿主細胞的染色體中。因此，U6啟動子驅動shRNA的組成型表達對靶基因的干擾是穩(wěn)定和永久的，這對于某些實驗目標來說可能是一個重要的優(yōu)勢。如可對培養(yǎng)細胞或活體干擾表型進行長期分析，有助于分離具有不同干擾水平和/或不同表型的克??；當干擾載體攜帶熒光標記如EGFP時，可通過流式分選具有不同熒光強度（熒光強度和整合數(shù)量有關，進而與干擾程度有關）的細胞。

可逆性：如果再次使用輔助質粒轉染攜帶PiggyBac shRNA轉座子的細胞，可將表達shRNA的轉座子從某些細胞的基因組中切除，而不留下任何痕跡。但是，這種情況只發(fā)生在一小部分細胞中。

技術簡單：通過常規(guī)轉染即可把質粒轉入細胞，相比起病毒載體需要進行病毒包裝，過程更簡單。

安全性：常規(guī)轉染不會引起與病毒載體相關的安全性問題。

轉染細胞類型受限：PiggyBac載體進入細胞依賴于轉染。不同類型的細胞，其轉染效率差異非常大。非分裂細胞通常比分裂細胞更難轉染，原代細胞比永生化細胞更難轉染，一些重要的細胞類型轉染難度更大，如神經(jīng)元和胰島β細胞。另外，質粒轉染主要局限于體外應用，很少應用于體內實驗（但可以應用于轉基因動物模型制備）。以上因素在一定程度上制約了piggyBac系統(tǒng)的應用。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the piggyBac transpose can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.

U6 Promoter: Drives expression of the shRNA. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.

Sense, Antisense: These sequences are derived from your target sequences, and are transcribed to form the stem portion of the “hairpin” structure of the shRNA.

Loop: This optimized sequence is transcribed to form the loop portion of the shRNA “hairpin” structure.

Terminator: Terminates transcription of the shRNA.

hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

rBG pA: Rabbit β-globin polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream marker gene.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.